产品目录

本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织中提取总蛋白。配合其他组份时，也可以用于植物、细菌、真菌、酵母等样品的总蛋白提取。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫共沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，下游应用范围广，提取液裂解细胞的能力较温和，需要根据实际样本情况优化裂解时间。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒(HR0165)。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理(HR0389)。

本试剂盒按每个处理样本50mg细胞/组织计(大约50μL细胞压积)，如果需要处理大量的细胞/组织，将提取液按细胞体积的1:10加入细胞沉淀即可。每个50T试剂盒大约可以提取2.5g细胞/组织样本的总蛋白。根据不同的细胞类型，100mg细胞沉淀物(107个细胞)的总蛋白质产量大约为6mg左右。

• 使用方便，不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 总蛋白提取液：含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃保存，开盖使用后-20℃保存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如果试剂不能短时间用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
  
• Western实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
  
• 离心机转速有相对离心力(RCF,×g)和每分钟转速(RPM)两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
  G=r×1.118×10^-5×rpm²(r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米)
  例如：转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力(RCF,×g)为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2(×g)。

• 提取液制备：
  每500μL冷的总蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ① 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ② 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ③ 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
  ④ 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 取5×10⁶个细胞，在4℃，2500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
  注：
  ① 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  ② 一般按细胞压积的10倍左右加入裂解液即可。如果需要提高得到的蛋白样品浓度，可以将细胞：提取液用量比例调整为1:5.
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：加入PBS混匀，2500×g离心5分钟。
  
• 每5×10⁶～1×10⁷个细胞(大约50mg细胞/50μL细胞压积)中加入500μL冷的总蛋白提取液，吹打混匀后，在4℃条件下振荡20～30分钟，至细胞充分裂解，无明显细胞沉淀。
  注：
  ① 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ② 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  
• 在4℃,12000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ① 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品货号：HR0329。
  ② 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 提取液制备：
  每500μL冷的总蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ① 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ② 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ③ 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
  ④ 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 小心吸取贴壁细胞的培养液。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：加入PBS混匀，2500×g离心5分钟。
  
• 加入适量冷的总蛋白提取液，振荡15～30分钟，至细胞充分裂解，用细胞刮刀刮一遍，将裂解液吸入另一干净离心管。
  注：
  ① 推荐裂解液使用量：
  60mm培养皿250μL～500μL；100mm培养皿500μL～1mL；6孔板200～250μL/孔；24孔板100μL/孔；96孔板50μL/孔；75cm2培养瓶500μL～1mL。
  ② 也可用细胞刮刀刮下细胞/胰酶将细胞消化下来后按悬浮细胞操作步骤进行。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ① 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品货号：HR0329。
  ② 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 提取液制备：
  每500μL冷的总蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ① 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ② 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ③ 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
  ④ 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 取50～100mg组织样本，用PBS洗干净，用手术剪刀尽可能剪碎，加入500μL总蛋白提取液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
  注：
  ① 如组织样品很细小，可剪碎后直接加入提取液振荡15分钟，可以不用匀浆器。
  ② 一般按组织：提取液用量1:10(w/v)左右加入提取液即可。如果需要提高得到的蛋白样品浓度，可以将组织：提取液用量比例调整为1:5.
  ③ 也可用液氮研磨的方法，采用常规的液氮研磨方法即可。
  
• 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡10～20分钟。
  注：
  ① 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ② 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  
• 在4℃，10000～14000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ① 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品货号：HR0329。
  ② 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 细胞裂解速度慢？
  为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。
  
• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。